PI3K guida la sintesi de novo del coenzima A dalla vitamina B5

Natura volume 608, pagine 192–198 (2022)Citare questo articolo

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In risposta agli ormoni e ai fattori di crescita, la rete di segnalazione della fosfoinositide-3-chinasi di classe I (PI3K) funziona come un importante regolatore del metabolismo e della crescita, regolando l'assorbimento dei nutrienti cellulari, la generazione di energia, riducendo la produzione di cofattori e la biosintesi delle macromolecole1. Molte delle mutazioni driver nel cancro con la più alta recidiva, inclusi i recettori tirosina chinasi, Ras, PTEN e PI3K, attivano patologicamente la segnalazione PI3K2,3. Tuttavia, la nostra comprensione del programma metabolico centrale controllato da PI3K è quasi certamente incompleta. Qui, utilizzando la metabolomica basata sulla spettrometria di massa e il tracciamento isotopico, mostriamo che la segnalazione PI3K stimola la sintesi de novo di uno dei cofattori metabolici più importanti: il coenzima A (CoA). Il CoA è il principale trasportatore di gruppi acilici attivati ​​nelle cellule4,5 ed è sintetizzato da cisteina, ATP e dal nutriente essenziale vitamina B5 (noto anche come pantotenato)6,7. Identifichiamo il pantotenato chinasi 2 (PANK2) e PANK4 come substrati della chinasi effettrice PI3K AKT8. Sebbene sia noto che PANK2 catalizza la prima fase che determina la velocità della sintesi di CoA, scopriamo che il PANK49 minimamente caratterizzato ma altamente conservato è un soppressore limitante della sintesi di CoA attraverso la sua attività del metabolita fosfatasi. La fosforilazione di PANK4 da parte di AKT allevia questa soppressione. In definitiva, l’asse PI3K-PANK4 regola l’abbondanza di acetil-CoA e altri acil-CoA, processi dipendenti dal CoA come il metabolismo e la proliferazione dei lipidi. Proponiamo che questi meccanismi regolatori coordinino le forniture cellulari di CoA con le richieste del metabolismo e della crescita guidati da ormoni/fattori di crescita o guidati da oncogeni.

Nella ricerca dei componenti principali del programma metabolico guidato dalla PI3K di classe I, abbiamo eseguito uno schermo metabolomico basato su cromatografia liquida mirata e non marcata, spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) utilizzando la linea cellulare epiteliale del seno umano non trasformata MCF10A . PI3K ha un ruolo importante nella crescita delle ghiandole mammarie ed è uno dei principali fattori che causano il cancro al seno10,11. Le cellule MCF10A dipendono in modo simile dalla segnalazione PI3K stimolata dal fattore di crescita per la crescita e la proliferazione. Le cellule sono state trattate con insulina per stimolare acutamente la segnalazione PI3K in presenza o assenza di un inibitore PI3K (Dati estesi Fig. 1a). Oltre a indurre cambiamenti nelle vie metaboliche note regolate da PI3K1, abbiamo osservato che l'inibizione di PI3K aumentava la concentrazione di pantotenato, un nutriente essenziale noto anche come vitamina B5 (VB5). VB5 viene utilizzato unicamente in combinazione con cisteina e ATP per la biosintesi de novo del cofattore CoA6,7 (Fig. 1a). Essendo il principale trasportatore di gruppi acilici attivati ​​all'interno delle cellule, il CoA ha un ruolo fondamentale in una varietà di processi metabolici fondamentali, tra cui il catabolismo dei nutrienti e la sintesi lipidica4,5.

a, Il percorso di sintesi del CoA de novo. b, trattamenti con insulina (100 nM) e inibitore di PI3K (GDC-0941 o GDC-0032; 2 μM) con marcatura simultanea di 13C315N1-VB5 (3 ore), preceduti da deprivazione del siero/fattore di crescita (18 ore) e pretrattamento con inibitore (15 min) nelle celle MCF10A. c, cellule MCF10A knockin PIK3CA+/+ e PIK3CAp.H1047R/+-con trattamento con inibitore PI3K (GDC-0941; 2 μM). L'etichettatura e le condizioni erano altrimenti descritte in b. d, CoA estratto con acido e acil-CoA a catena corta con le cellule e le condizioni descritte in b, tranne con trattamenti di 4 ore ed etichettatura. e, Etichettatura radioattiva 14C-VB5 (3 ore) con le cellule e le condizioni altrimenti descritte in b, seguita da un inseguimento (1 ora) nel mezzo senza VB5. Disintegrazioni al minuto (DPM) normalizzate alle proteine. f, trattamenti con inibitore di AKT (GDC-0068, 2 μΜ) e inibitore di mTORC1 (rapamicina, 100 nM) con concomitante etichettatura 13C315N1-VB5 (3 h) di cellule MCF10A che esprimono wild-type marcato con HA inducibile dalla doxiciclina (Dox) (WT ) o AKT costitutivamente attivo (E17K). I trattamenti e l'etichettatura sono stati preceduti dall'incubazione della doxiciclina (48 ore), dalla deprivazione del siero e del fattore di crescita (18 ore) e dal pretrattamento con gli inibitori (15 minuti). g, trattamenti con inibitore AKT (GDC-0068, 2 μΜ) e inibitore ACLY (NDI-091143, 15 μM) con le cellule, etichettatura e condizioni altrimenti come descritto in f. Per b–d, f e g, i metaboliti sono stati misurati utilizzando LC–MS/MS e normalizzati in proteine; metaboliti marcati (massa + 4 [M + 4]); l'abbondanza frazionaria è [M + 4]/totale. Per i grafici della variazione percentuale, la media del gruppo di trattamento più a sinistra è stata impostata sullo 0%. Per b – g, n = 3 repliche biologiche (cerchi). I dati sono media ± sem L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi della varianza a una via (ANOVA) con il test di Tukey; gli asterischi (*) indicano differenze significative rispetto ai gruppi di trattamento contrassegnati con pugnali (†) o tra trattamenti indicati con parentesi (P < 0,05). L'analisi immunoblotting ha analizzato le proteine ​​totali e fosforilate (p).